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细胞色素C采用的技术指导工作分析说明
点击次数:583 发布时间:2018-06-19
   细胞色素C是一类含有铁啉基团的电子传递蛋白,只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色素C是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间,是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶,并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。
  实验目的:
  1、通过细胞色素C的制备,了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤
  2、掌握制备细胞色素C的操作技术及含量的测定方法
  实验原理:
  细胞色素是一类含有铁啉基团的电子传递蛋白,只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色素C是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B和细胞色素氧化酶之间,是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶,并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。
  结果表明,细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间;不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高,等电点为10.7,含铁量为0.38%~0.43%,Mr为12000~13000,猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。
  细胞色素C分为氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定,不易变性。pH 7.2~10.2,100℃加热3分钟,细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%,若增加加热时间,氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定,可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的,因为比较稳定并易于保存。
  细胞色素C 是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量zui为丰富。细胞色素C 位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,分子量约为13000,肽链中含有19个赖氨酸残基,为一碱性蛋白, 等电点(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠,它是一种阳离子交换剂,细胞色素C 分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷,它可与沸石分子上的钠离子发生交换,从而被沸石吸附。装入层析柱后,用25%硫酸铵洗脱,又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度,主要为去除杂蛋白。另外乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合,必须严格控制酸用量。
  细胞色素C与材料试剂
  1、 设备:组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱。
  2、 仪器:剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管。
  3、 试剂:联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、、人造沸石、氢氧化铵。
  4、 材料:新鲜猪心(2个)。
  结果表明,细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间;不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高,等电点为10.7,含铁量为0.38%~0.43%,Mr为12000~13000,猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。细胞色素C分为氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定,不易变性。pH 7.2~10.2, 100℃加热3分钟,细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%,若增加加热时间,氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定,可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的,因为比较稳定并易于保存。
  细胞色素C不是根据辅基来命名;与其他三类细胞色素非共价结合血红素不同的是,细胞色素c通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合。细胞色素e尚无,但有细胞色素f(细胞色素c中的一种)。[3]此外,细胞色素d仅存在于细菌中。
  在线粒体和叶绿体中,细胞色素常常结合在电子传递和相关代谢途径的复合物酶中。
  细胞色素C过敏试验
  细胞色素C是一种辅酶,在生物氧化过程中起着传递电子的作用,改善缺氧时的细胞呼吸,促进物质代谢,临床多用做能量合剂的配方。应用时要警惕过敏反应。为防止过敏反应,在用药前应先作过敏试验。
  一、皮试液的配制
  取细胞色素C(每支2ml含15mg)0.1ml加等渗盐水至1ml,每ml含 0.75mg 。
  二、试验方法
  (一) 皮内试验 取细胞色素C试验液 0.1ml(含0.075mg),作皮内注射,观察20分钟后,判断试验结果。
  (二)划痕试验 取细胞色素C原液(每ml含2.5mg)1滴,滴于前臂内侧皮肤上作划痕法(以无菌针头透过药液,划刺皮肤两道,长约5mm,其深度以不出血为宜。即划破皮不出血。)观察20分钟后判断试验结果。
  三、试验结果判断
  局部发红,直径大于1cm,有丘疹者阳性。

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